Vero細(xì)胞DNA殘留定量檢測試劑盒說明書
貨號：71022
VERO 殘留 DNA 檢測試劑盒是用于定量檢測各種生物制品及藥品的中間品、半成品和成品中殘留的 VERO 宿主細(xì)胞DNA，試劑盒采用熒光探針原理，定量檢測樣本中 VERO 殘留DNA。具有檢測快速，專一性強(qiáng)，性能可靠，最低檢測限可以達(dá)到 fg 級別等特點(diǎn)。試劑盒內(nèi)含 VERO DNA 定量參考品，已溯源至國家標(biāo)準(zhǔn)品。
| 組份 |
裝量 |
數(shù)量 |
儲存條件 |
| VERO DNA 定量參考品 |
15ng/瓶 |
1瓶 |
2-8℃及以下 |
VERO 熒光定量PCR試劑
（含ROX校正染料） |
680uL/瓶 |
3管 |
-20℃，避光 |
| 復(fù)溶液 |
1.5ml/瓶 |
3瓶 |
2-8℃及以下 |
- 規(guī)格：100 Reactions。
- 有效期: 規(guī)定儲存條件下 12 個(gè)月。
- 已測試機(jī)型：
?PRISM? 7500 Real-Time PCR System (ABI)
?CFX96 (Bio-Rad)
?LineGene 9600 (博日)
?Roche 480 Lightcycler
?1.5ml 無菌低吸附離心管
?1000μl，100μl，10μl 無菌低吸附帶濾芯槍頭
?相關(guān)設(shè)備
?熒光定量 PCR 儀
?1000μl，100μl，10μl 移液槍
?操作過程
- VERO DNA 定量參考品的稀釋和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
將試劑盒中提供的VERO DNA凍干定量參考品15ng,使用 0.5ml 復(fù)溶液溶解 。之后按照如下步驟依次稀釋至濃度為 30ng/ml、3ng/ml、0.3ng/ml、0.03ng/ml、0.003ng/ml(3fg/ul)。
具體操作如下：
- 向試劑盒中提供的VERO DNA 凍干品中加入 0.5mL DNA復(fù)溶液，蓋好膠塞，輕微振蕩混勻，此樣品為ST1。
- 取 5 支干凈的 1.5ml 離心管，分別標(biāo)記為 ST0，ST2，ST3，ST4，ST5。
- 每管分別加入 90μl DNA 復(fù)溶液。
- 取 10μl 的 VERO DNA 定量參考品 ST1，加入 ST2 管，瞬時(shí)振蕩混勻后短時(shí)間快速離心 5s，重復(fù) 3 次以確保定量參考品與 DNA復(fù)溶液充分混勻。
- 按表 1 依次進(jìn)行稀釋操作，稀釋步驟同 4。
表 1. VERO DNA 定量參考品的稀釋
| 稀釋管 |
稀釋體積 |
濃度(ng/ml) |
| ST1 |
1瓶VERO DNA 定量參考品+500μl DNA復(fù)溶液 |
30 |
| ST2 |
10μl ST1+90μl DNA復(fù)溶液 |
3 |
| ST3 |
10μl ST2+90μl DNA復(fù)溶液 |
0.3 |
| ST4 |
10μl ST3+90μl DNA復(fù)溶液 |
0.03 |
| ST5 |
10μl ST4+90μl DNA復(fù)溶液 |
0.003 |
| ST0 |
90μl DNA 復(fù)溶液 |
0 |
已融化未使用的 DNA 復(fù)溶液可保存于 2-8℃及以下。
根據(jù)需要設(shè)置 ERC 中的 VERO DNA 加樣濃度（以制備加 0.03ng/ml VERO DNA 量的樣本 ERC 為例），具體操作如下：
- 取 100μl 待測樣本加入 1.5ml 干凈的離心管中。
- 再加入 10μl ST3，混勻，標(biāo)記為樣本 ERC。
樣本 ERC 和同批待測樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備成樣本 ERC 純化液。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性質(zhì)控，具體操作如下：
- 取100μl 樣本基質(zhì)溶液(或DNA 復(fù)溶液)加入 1.5ml 干凈的離心管中標(biāo)記為陰性質(zhì)控 NCS。
陰性質(zhì)控 NCS 和同批待測樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備成陰性質(zhì)控 NCS 純化液。
- 根據(jù)所要檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測樣本數(shù)量，計(jì)算所需反應(yīng)孔數(shù)，一般做 3 個(gè)重復(fù)孔/樣。
- 反應(yīng)孔數(shù)=（5 個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線+ 1 個(gè)無模板對照 NTC+ 1 個(gè)陰性質(zhì)控 NCS +待測樣本×2）×3
待測樣本×2 是因?yàn)槲覀兺扑]每個(gè)待測樣本檢測時(shí)都應(yīng)同時(shí)做樣本ERC。
- 從試劑盒內(nèi)取出VERO 熒光定量PCR試劑一管，化凍至完全融化，置于冰上。
- 按表 2 所示加樣：
表 2.各反應(yīng)孔加樣示例
| 標(biāo)準(zhǔn)曲線 |
20μl VERO 熒光定量PCR試劑 + 5μl ST1/ST2/ST3/ST4/ ST5 |
| NTC |
20μl VERO 熒光定量PCR試劑 + 5μl DNA 復(fù)溶液 |
| NCS |
20μl VERO 熒光定量PCR試劑 + 5μl NCS 純化液 |
| 待測樣本 |
20μl VERO 熒光定量PCR試劑 + 5μl 待測樣本純化液 |
| 樣本 ERC |
20μl VERO 熒光定量PCR試劑 + 5μl 樣本 ERC 純化液 |
加樣完成后每孔總體積為 25μl，本凍干試劑含有ROX染料。
表 3. 96 孔板排版示例
| NTC |
|
S1 |
S1 |
S1 |
S1 ERC |
S1 ERC |
S1 ERC |
|
|
|
|
A |
| NTC |
|
S2 |
S2 |
S2 |
S2 ERC |
S2 ERC |
S2 ERC |
|
ST5 |
ST5 |
ST5 |
B |
| TC |
|
S3 |
S3 |
S3 |
S3 ERC |
S3 ERC |
S3 ERC |
|
ST4 |
ST4 |
ST4 |
C |
| |
|
S4 |
S4 |
S4 |
S4
ERC |
S4
ERC |
S4
ERC |
|
ST3 |
ST3 |
ST3 |
D |
| NCS |
|
S5 |
S5 |
S5 |
S5 ERC |
S5 ERC |
S5 ERC |
|
ST2 |
ST2 |
ST2 |
E |
| NCS |
|
|
|
|
|
|
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|
ST1 |
ST1 |
ST1 |
F |
| NCS |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
G |
| |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
H |
| 1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
表3為孔板排布示例圖，該示例表示的是檢測5 個(gè)濃度梯度的VERO DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線
（ST1～ST5）、1 個(gè)無模板對照 NTC、1 個(gè)陰性質(zhì)控 NCS、5 個(gè)待測樣本（S1～S5）和每個(gè)樣本的 ERC（S1 ERC～S5 ERC）。每個(gè)檢測做 3 個(gè)重復(fù)孔。實(shí)際檢測時(shí)可根據(jù)樣本多少，參照此示例進(jìn)行 96 孔板排版加樣。
5. 將 96 孔板用光學(xué)膜封閉，輕微震蕩混勻，短時(shí)間快速離心 10s 后放入 qPCR 儀。
以 AB 公司 7500 qPCR 儀、軟件版本 2.3 為例。
- 創(chuàng)建空白新程序，選擇絕對定量檢測模板。
- 創(chuàng)建新檢測探針，命名為 VERO-DNA，選擇報(bào)告熒光基團(tuán)為FAM，猝滅熒光基團(tuán)為 none，檢測參比熒光為 ROX。
- 設(shè)置兩步法反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 10min；95℃ 30 s，60℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)；反應(yīng)體積 25μl 。
以 AB 公司 7500 qPCR 儀、軟件版本 2.3 為例。
- 在 Results 的 Amplification Plot 面板中，將 Threshold 設(shè)置為 0.02，點(diǎn)擊 Analyze，此時(shí)可初步查看擴(kuò)增曲線的形態(tài)是否正常。
- 在 Results 的 Plate 面板中，將標(biāo)準(zhǔn)曲線孔的 Task 一欄設(shè)置為Standard，并且在 Quantity 一欄分別賦值為30ng/ml、3ng/ml、0.3ng/ml、0.03ng/ml、0.003ng/ml，并且在相應(yīng)的 Sample Name 一欄中命名為 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。
- 在 Results 的 Plate 面板中，將無模板對照 NTC 孔的 Task 一欄設(shè)置為 NTC，將陰性質(zhì)控 NCS 孔、待測樣本孔、樣本 ERC 孔的Task 一欄設(shè)置為 Unknown，并且在相應(yīng)的 Sample Name 一欄中命名為 NTC、NCS、S、ERC，之后點(diǎn)擊 。
- 在 Results 的 Standard Curve 面板中，可讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。
- 在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一欄可讀取無模板對照NTC、陰性質(zhì)控 NCS、待測樣本、樣本 ERC 的檢測值，單位為ng/ml。后續(xù)可在檢測報(bào)告中將單位換算為 pg/μl 或pg/ml。
結(jié)果分析的參數(shù)設(shè)置需依據(jù)具體的機(jī)型及使用的軟件版 本，一般也可由儀器自動判讀。
根據(jù)待測樣本和樣本 ERC 的檢測結(jié)果計(jì)算加樣回收率， 加樣回收率要求在 50%～150%之間。
陰性質(zhì)控 NCS 的 Ct 值應(yīng)大于標(biāo)曲最低濃度 Ct 均值。
無模板對照 NTC 的檢測結(jié)果應(yīng)為 Undetermined 或 Ct 值≥35。
